Швидкий набір мутагенезу, спрямований на сайт

Шаблон А-1

■ Шаблон містить білкові домішки або інгібітори Taq тощо. - Очистіть матрицю ДНК, видаліть білкові домішки або витягніть матричну ДНК за допомогою наборів для очищення.

■ Денатурація шаблону не завершена - - належним чином збільшіть температуру денатурації та подовжте час денатурації.

■ Деградація шаблону-повторно підготуйте шаблон.

Буквар А-2

■ Погана якість грунтовки-повторно синтезуйте грунтовку.

■ Деградація грунтовки —— Розріжте грунтовки з високою концентрацією на невеликий об’єм для збереження. Уникайте багаторазового заморожування та розморожування або тривалого кріоконсервування при 4 ° C.

■ Неправильна конструкція грунтовки (наприклад, довжина ґрунтовки недостатня, димер утворений між праймерами тощо)

А-3 мг²⁺концентрація

■ Mg²⁺ концентрація занадто низька —— Правильно збільшити Mg²⁺ концентрація: Оптимізуйте Mg²⁺ концентрації шляхом серії реакцій від 1 мМ до 3 мМ з інтервалом 0,5 мМ для визначення оптимального Mg²⁺ концентрація для кожного шаблону та праймера.

A-4 Температура відпалу

■ Висока температура відпалу впливає на зв'язування ґрунтовки та шаблону. —— Зменшіть температуру відпалу та оптимізуйте стан з градієнтом 2 ° C.

А-5 Час продовження

■ Короткий час подовження —— Збільште час подовження.

Явища: Негативні зразки також показують смуги цільової послідовності.

A-1 Забруднення ПЛР

■ Перехресне забруднення послідовності мішеней або продуктів ампліфікації —— Обережно, щоб не пропустити піпеткою зразок, що містить послідовність мішені, у негативній пробі або вилити їх з пробірки для центрифуги. Реактиви або обладнання слід автоклавувати для усунення наявних нуклеїнових кислот, а наявність забруднення слід визначити шляхом експериментів з негативним контролем.

■ Забруднення реагентів —— Розподіліть реактиви рівною мірою та зберігайте при низькій температурі.

А-2 Праймr

■ Mg²⁺ концентрація занадто низька —— Правильно збільшити Mg²⁺ концентрація: Оптимізуйте Mg²⁺ концентрації шляхом серії реакцій від 1 мМ до 3 мМ з інтервалом 0,5 мМ для визначення оптимального Mg²⁺ концентрація для кожного шаблону та праймера.

■ Неправильний дизайн праймера, а цільова послідовність має гомологію з нецільовою послідовністю. —— Грунтовки для повторного проектування.

Явища: смуги ампліфікації ПЛР не відповідають очікуваному розміру, або великі, або малі, або іноді зустрічаються як специфічні смуги ампліфікації, так і неспецифічні смуги ампліфікації.

Буквар А-1

■ Погана специфічність ґрунтовки

—— Грунтовка для повторного дизайну.

■ Концентрація ґрунтовки занадто висока —— Правильно збільшуйте температуру денатурації та подовжуйте час денатурації.

А-2 мг²⁺ концентрація

■ Mg²⁺ концентрація надто висока —— Правильно зменшіть концентрацію Mg2+: Оптимізуйте Mg²⁺ концентрації шляхом серії реакцій від 1 мМ до 3 мМ з інтервалом 0,5 мМ для визначення оптимального Mg²⁺ концентрація для кожного шаблону та праймера.

А-3 Термостабільна полімераза

■ Надмірна кількість ферменту - відповідно зменшуйте кількість ферменту з інтервалом 0,5 ОД.

A-4 Температура відпалу

■ Температура відпалу занадто низька —— Відповідно збільште температуру відпалу або застосуйте двоступеневий метод відпалу

А-5 ПЛР цикли

■ Занадто багато циклів ПЛР —— Зменшіть кількість циклів ПЛР.

Буквар А-1—— Погана специфічність —— Переробити грунтовку заново, змінити положення та довжину ґрунтовки, щоб підвищити її специфічність; або виконати вкладену ПЛР.

А-2 шаблонна ДНК

—— Шаблон не чистий —— Очистіть шаблон або витягніть ДНК наборами для очищення.

А-3 мг²⁺ концентрація

——Мг²⁺ концентрація занадто висока - належним чином зменшіть Mg²⁺ концентрація: Оптимізуйте Mg²⁺ концентрації шляхом серії реакцій від 1 мМ до 3 мМ з інтервалом 0,5 мМ для визначення оптимального Mg²⁺ концентрація для кожного шаблону та праймера.

A-4 dNTP

—— Концентрація dNTP занадто висока —— Відповідно зменшіть концентрацію dNTP

А-5 Температура відпалу

—— Занадто низька температура відпалу —— Відповідно збільште температуру відпалу

Цикли А-6

—— Занадто багато циклів ——Оптимізуйте номер циклу

Перший крок - вибір відповідної полімерази. Звичайна Taq-полімераза не може коректуватися через відсутність 3'-5 'екзонуклеазної активності, а невідповідність значно знизить ефективність розширення фрагментів. Тому звичайна Taq -полімераза не може ефективно ампліфікувати фрагменти -мішені розміром більше 5 кб. Для поліпшення ефективності розширення та задоволення потреб ампліфікації з довгими фрагментами слід вибрати полімеразу Taq зі спеціальною модифікацією або іншу високоточну полімеразу. Крім того, ампліфікація довгих фрагментів також вимагає відповідного коригування дизайну грунтовки, часу денатурації, часу розширення, рН буфера тощо. Зазвичай праймери з 18-24 п.н. можуть призвести до кращого врожаю. Щоб запобігти пошкодженню шаблону, час денатурації при 94 ° C слід скоротити до 30 секунд або менше за цикл, а час підвищення температури до 94 ° C перед ампліфікацією - менше 1 хвилини. Крім того, встановлення температури розширення приблизно на 68 ° C та розрахунок часу розширення відповідно до швидкості 1 кб/хв може забезпечити ефективне ампліфікацію довгих фрагментів.

Частоту помилок ампліфікації ПЛР можна зменшити, використовуючи різні ДНК -полімерази з високою точністю. Серед усіх виявлених на сьогодні ДНК -полімераз Taq фермент Pfu має найнижчу частоту помилок і найвищу точність (див. Додану таблицю). На додаток до відбору ферментів, дослідники можуть додатково зменшити швидкість мутації ПЛР шляхом оптимізації умов реакції, включаючи оптимізацію складу буфера, концентрацію термостабільної полімерази та оптимізацію числа циклів ПЛР.